Разработка сорбционно-хроматографического метода выделения комплекса ферментов

Вид работы: Дипломная работа | Предмет работы: Общая химия | Количество листов: 73

Для очистки предварительно осветленных и сконцентрированных белковых смесей, к которым можно и отнести профильтрованный нативный раствор Asp. оryzae, существует три основных типа хроматографического разделения: ионообменная, аффинная и гель-хроматография. Ионообменные и аффинные хроматографические методы позволяют быстро делить большие объемы растворов пептидов. Ионообменные материалы дешевле и, как следствие, предпочтительны на более ранних стадиях очистки. Ионнообменая сорбция – это процесс, основанный на обратимом взаимодействии заряженной белковой молекулы и сорбентом. Обмен ионами между участниками сорбции происходит в эквивалентном соотношении [14]. Десорбция – это процесс регенерации адсорбентов и абсорбентов, который заключается в удалении поглощенных ими веществ (газов, паров, жидкостей). Это позволяет многократно использовать сорбент, что делает производственный процесс оптимальней. Аффинная хроматография – это метод очистки и разделения белков, основанный на их избирательном взаимодействии с лигандом, который ковалентно связан с инертным носителем. Процесс проводят в динамических или статических условиях. После проведения сорбции фермента, сорбент промывают буферным раствором для удаления не связавшихся компонентов. Десорбцию проводят органическими растворителями или в ходе изменения рН раствора, используемого для промывки. Гель-фильтрация - (эксклюзионная хроматография) – это разделение смеси веществ по молекулярной массе в ходе фильтрации через пористые гели. Частицы геля проницаемы из-за внутренних каналов с определенным средним диаметром [15]. Гель-фильтрацию проводят на хроматографических колонках, которые заполнены предварительно набухшим гранулированным гелем, элюируя разделяемые вещества разбавленным солевым или буферным растворами. Эффективность эксклюзионной хроматографии определяется размерами пор геля и величиной каждой гранулы. Небольшие молекулы вещества (во много раз меньше ячейки геля) диффундируют внутрь гранулы и задерживаются в ходе фильтрации, более крупные молекулы проходят в поры между гранулами. Данный метод прост и проводится в мягких условиях, которые исключают денатурацию биологически активных белков (в нашем случае ферментов).

Оглавление
Введение 1
1. Литературный обзор 1
1.1 Промышленное производство ферментов 1
1.1.1 Выбор штамма микроорганизма – продуцента 3
1.1.2 Приготовление питательной среды 3
1.1.3 Ферментация 4
1.1.4 Выделение и очистка ферментов 5
1.2 Источники ферментов 5
1.3 Характеристика амилолитических, протеолитических и липолитических ферментов 8
1.3.1 Амилазы 8
1.3.2 Протеазы 10
1.3.3 Липазы 11
1.3.4 Физико-химические свойства кислой протеазы, липазы и α амилазы продуцента Aspergillus oryzae шт. 55 11
1.4 Методы выделения и очистки ферментов 12
1.4.1 Сорбционно-хроматографические методы 12
1.5 Характеристика используемых сорбентов 14
2. Экспериментальная часть 15
2.1 Объект исследования 15
2.2 Методы исследования 16
2.2.1 Культивирование продуцента Aspergillus oryzae шт. 55 16
2.2.2 Определение концентрации общего белка по методу Лоури 17
2.2.3 Определение амилолитической активности 18
2.2.3.1 Приготовление рабочих растворов 18
2.2.3.2 Методика определения активности амилазы 19
2.2.3.3 Расчет амилолитической активности 21
2.2.4 Определение протеолитической активности 21
2.2.4.1 Приготовление рабочих растворов 21
2.2.4.2 Методика определения активности кислой протеазы 22
2.2.4.3 Расчет протеолитической активности 24
2.2.5 Определение липолитической активности 24
2.2.5.1 Приготовление рабочих растворов 24
2.2.5.2 Методика определения активности липазы 26
2.2.5.3 Расчет активности липазы 26
2.2.6 Методика гель-хроматографического определения молекулярной массы ферментов в нативном растворе 27
2.2.7 Методика определения молекулярной массы белков нативного раствора методов электрофореза в полиакриламидном геле 28
2.2.7.1 Приготовление рабочих растворов 29
2.2.7.2 Ход эксперимента 31
2.2.8 Методика постановки экспериментов по изучению зависимости емкости сорбции от pH раствора 33
2.2.8.1 Подготовка сорбентов к работе 33
2.2.8.2 Ход эксперимента 34
2.2.9 Методика постановки экспериментов по изучению равновесных параметров сорбции комплекса ферментов 35
2.2.10 Методика проведения процесса ультрафильтрации 36
2.2.11 Методика проведения процессов сорбции/десорбции в динамических условиях 36
2.2.12 Методика статистической обработки результатов экспериментов 37
3. Результаты и обсуждения 38
3.1 Исследование компонентного состава нативного раствора методом гель-хроматографии 38
3.2 Исследование компонентного состава нативного раствора Aspergillus oryzae методом электрофореза в полиакриламидном геле 39
3.3 Выделение и очистка комплекса ферментов Aspergillus oryzae шт.55 сорбционно–хроматографическими методами 40
3.3.1 Выбор оптимального рН для проведения процесса сорбции комплекса ферментов 41
3.3.2 Исследование равновесных параметров процесса сорбции комплекса ферментов 42
3.3.2 Исследование динамических параметров сорбции 45
3.4 Заключение 47
4. Безопасность исследований 48
4.1 Характеристика условий труда 48
4.2 Безопасность работ с веществами и материалами 48
4.2.1 Токсичные и горючие вещества 49
4.2.2 Категорирование лаборатории по взрывопожарной и пожарной опасности 59
4.3 Микроклимат в помещении лаборатории 61
4.4 Вентиляция 62
4.5 Освещение 62
4.5.1 Расчет естественного освещения 62
4.5.2 Расчет искусственного освещения 63
4.6 Безопасность оборудования 64
4.6.1 Электробезопасность 64
4.6.2 Безопасность лабораторного оборудования 64
4.6.3 Безопасность работы на персональном компьютере 65
4.7 Заключение 65
Список использованных источников 65

ПОМОЩЬ С НАУЧНОЙ РАБОТОЙ

Подготовим для Вас работу по стандартам Вузов

Готовая работа с высокой уникальностью по минимальной цене

Срок выполнения от 2 часов

Антиплагиат более 70%

Быстрый заказ работы